奶粉中的維生素A、D3、E的測定（固相萃取-液相色譜法）

更新時(shí)間：2015-07-05

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目前對奶粉中脂溶性維生素A、D3、E測定的前處理方法多采用皂化方法去除脂肪[1-7]，皂化過程后使用大量的有機(jī)溶劑進(jìn)行液液萃取以洗除雜質(zhì)，操作步驟復(fù)雜，維生素D3樣品還需經(jīng)硅膠柱做進(jìn)一步的凈化才能進(jìn)行檢測，造成實(shí)驗(yàn)時(shí)間成本的增加，不利于大批量樣品的檢測。本文研究了利用固相萃取法作為奶粉樣品的前處理方法，液相色譜法作為檢測手段，實(shí)現(xiàn)同時(shí)測定奶粉中維生素A、D3、E的含量，該方法可簡化奶粉樣品的前處理過程，節(jié)省有機(jī)溶劑的使用，操作簡便。

1. 樣品處理

皂化提取：2g奶粉加入1mL水混勻，加入1 mL VC/乙醇溶液破壁處理，混勻，加入10mL氫氧化鉀堿液（1.25g/mL），55℃條件下，水浴皂化45min，取出冷卻至室溫，向皂化液中加入適量無水乙醇，使之含50%乙醇，6000r/min離心5min后，取上清液，用1至2個(gè)微孔過濾器對其進(jìn)行過濾，至Qdaura 卓睿™全自動固相萃取儀上樣管中作為待凈化液。

2. 固相萃取凈化

Qdaura^TM卓睿全自動固相萃取儀程序設(shè)定：5mL甲醇，和5mL水活化，加樣，10mL50%乙醇/水淋洗，抽干20min。2mL 丙酮，10mL乙酸乙酯洗脫，收集。收集液于40℃氮?dú)獯蹈桑?/SPAN>1mL甲醇定容，0.45um PTFE過濾器過濾，準(zhǔn)備進(jìn)液相色譜分析。

3. 色譜條件

液相色譜儀：LC-10F

色譜柱：Venusil MP C18，4.6 mm *150 mm，5µm；

流動相：甲醇；

流速：1mL/min；

柱溫：30℃；

進(jìn)樣量：20µL；

波長變化見表1：

表1 波長變化梯度表

組分	時(shí)間/min	波長/nm
維生素A	0	325
維生素D3	5	264
維生素E	9	294

4. 結(jié)果與討論

圖1 低濃度維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

從左至右依次為：維生素A（5.0µg/mL）、維生素D3（9.8µg/mL）、維生素E（99µg/mL）

4.1 工作曲線及檢出限

根據(jù)儀器對各個(gè)物質(zhì)的響應(yīng)情況，將維生素A、D3、E分別由儲備液用正己烷逐級稀釋，各稀釋成7個(gè)濃度，維生素A濃度范圍為0.25µg/mL~25µg/mL，維生素D3濃度范圍為0.30µg/mL~30µg/mL，維生素E濃度范圍為2.5µg/mL~250µg/mL，將溶液進(jìn)HPLC進(jìn)行檢測，計(jì)算出檢出限，回歸方程及檢出限見表2。可見，液相色譜儀對維生素A、D3、E的響應(yīng)與濃度呈良好的線性關(guān)系。

表2 線性回歸方程及檢出限

化合物	回歸方程	相關(guān)系數(shù)	檢出限 LOD* （µg/mL）
維生素A	y=55.572*x-1.517	1	0.02
維生素D3	y=57.608*x-1.9814	1	0.05
維生素E	y=8.1342*x-1.9094	1	0.39

圖2 皂化-固相萃取法色譜圖

4.2 皂化-固相萃取和傳統(tǒng)皂化-液液萃取法的實(shí)驗(yàn)效果對比

傳統(tǒng)皂化-液液萃取法參考《GB 5413.9—2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中維生素A、D、E 的測定》的樣品前處理2個(gè)奶粉（每個(gè)樣稱取2g）的平行樣，作為參照。同時(shí)以皂化固相萃取法做兩個(gè)平行樣品。

表3 傳統(tǒng)皂化-液液萃取法與皂化固相萃取法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比

	維生素A峰面積	維生素D峰面積	維生素E峰面積
傳統(tǒng)皂化-液液萃取法	778	0	148
皂化固相萃取法	1500	0	716

由于選用的奶粉VD含量較低，沒有檢出。

從上述對比可以看出，皂化固相萃取法相比國標(biāo)的皂化液液萃取法具有簡單的優(yōu)勢，同時(shí)萃取效果更好。*的缺點(diǎn)是出峰靠前的維生素A附近有較多的弱保留物質(zhì)的干擾，但是依靠MP C18的強(qiáng)大的分離能力，可以實(shí)現(xiàn)分離維生素A和干擾物質(zhì)的基線分離。同時(shí)這些弱保留的物質(zhì)很容易被洗脫出色譜柱，所以不會對色譜柱造成較大的污染。

4.2.3加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

表4 加標(biāo)回收率及精密度

	化合物	樣1（%）	樣2（%）	樣3（%）	樣4（%）	樣5（%）	平均回收率%	RSD（%，n=5）
低濃度加標(biāo)	維生素A	89.91	91.48	86.12	89.59	90.12	89.44	2.33
	維生D3	112.36	114.63	106.34	111.63	105.35	110.06	3.83
	維生素E	85.58	86.87	81.83	85.64	84.56	84.90	2.86
高濃度加標(biāo)	維生素A	88.84	91.48	89.61	86.43	89.57	89.18	2.04
	維生D3	93.06	94.65	93.19	90.38	92.86	92.83	1.66
	維生素E	86.68	87.62	87.00	83.25	85.94	86.10	1.98

4.2.3 實(shí)際樣品檢測

根據(jù)所建立的方法分析了從市場上購買的3種品牌奶粉，分別編號為1號、2號和3號按照上述方法進(jìn)行樣品處理和檢測，所得維生素A、D3和E的含量結(jié)果見表6。

圖7. 2號奶粉樣品色譜圖

表6 奶粉中維生素含量（µg/g）

化合物	1號（µg/g）	2號（µg/g）	3號（µg/g）
維生素A	6.008	42.5	165.0
維生素D3	0.392	0.000	0.463
維生素E	5.712	6.231	9.344

4.3 結(jié)論

采用改進(jìn)后的皂化-固相萃取方法來替代傳統(tǒng)的皂化法來測定奶粉中維生素含量，皂化能充分提取出奶粉中維生素A，D，E，再經(jīng)過Cleanert Vitamin固相萃取柱進(jìn)行凈化吸附洗脫，既避免了傳統(tǒng)皂化中液液萃取中有機(jī)溶劑的大量使用，也簡化了操作步驟，同時(shí)能滿足一般奶粉樣品的含量分析要求。

5.訂貨信息

產(chǎn)品名稱	規(guī)格包裝	訂貨號
LC-10F液相色譜儀	10ml/min，梯度系統(tǒng)，200-800nm雙波長檢測器	FL-LC010GS
LC-10F液相色譜儀	配紫外可變波長檢測器	LC-10F
CC-100分析型色譜柱溫箱	溫控范圍：5-70℃；可安裝1-2支300mm色譜柱	CC-100
Qdaura 卓睿™全自動固相萃取儀	4通道24位	SPE-40
Cleanert Vitamin脂溶性維生素萃取柱	1g/12mL , 20支/pk	V00012(報(bào)價(jià)：1360元/盒）
Venusil MP C18液相色譜柱	4.6 mm x150 mm，5µm	V952505-0
微孔過濾膜（PTFE疏水）-雙膜	045µm,直徑13mm,100/pk	AS041345-P
微孔過濾膜（PVDF親水）-雙膜	0.45µm,直徑13mm,100/pk	AS073345-G
一次性無菌注射器	5mL, 100/pk	ZSQ-5ML
1.5mL樣品瓶	100/pk	1109-0519
1.5mL樣品瓶蓋	100/pk	0915-1819
甲醇	4×4L/瓶	AH230-4
乙醇	4×4L/箱	AH090-4
乙酸乙酯	4×4L/箱	AH100-4
正己烷	4×4L/箱	AH216-4

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